TOPO kloniranje jeproces kloniranja koje koristi , u pravilu , 3 ‘a ostatke koji su termodinamički nestabilan i kombinira ih s TAQ DNA polimeraze . Osim toga , postupak koristi lančanom reakcijom polimeraze ( PCR proizvod svježi ) koji moraju biti pohranjeni na 4 stupnjeva Celzija . Ovaj oblik kloniranja optimizira aktivne prema topoizomerazi I molekule dodane na kraju linearnog vektora . Za obavljanje Topo kloniranje ,određeni protokol treba slijediti . Priprema

Neki osnovni koraci mogu poduzeti kako bi ubrzali cjelokupni proces kloniranja Topo i osigurati njegov uspjeh . Prvo , cijevi od živih stanica treba staviti na led kako bi održali svoju prihvatljivost . Zatim ,super optimalna kultura ( SOC ) medij , rast bakterija obogaćena hranjivim tvarima , treba dovesti na sobnu temperaturu . Selektivni ploče treba onda biti pre – grijao na 37 stupnjeva Celzijusa , tako da su u potpunosti spremni , kada dođe vrijeme da ih koriste .
Kombinirajući Sastojci

za kloniranje Postupak , u kombinaciji 2 mikrolitara lančane reakcije polimeraze ( PCR) proizvoda , 0,5 mikrolitara otopine soli i 0,5 mikrolitara klonirajući vektor treba biti kombinirani u 0.5 – mililitru epruvetu za centrifugiranje . Jednom u kombinaciji , ovi sastojci se treba postaviti na sobnoj temperaturi i ostavi da se inkubira na pet do deset minuta . Zatim , kombinirani sastojci će biti dodan u ” Top – 10 kemijski nadležnim stanica” u 50 – mikrolitarskom cijevi i stavi na led za dodatnih deset minuta . Nakon toga , stanice se mogu toplinski šoku na 42 stupnjeva Celzijusa i točno stavljene na led tijekom dodatnih 180 minuta prije ul SOC medija se dodaje . Ova mješavina tada bi trebao biti uzdrmano u vodoravnom smjeru na 200 okretaja u minuti za dodatnih sat vremena na 37 stupnjeva Celzijusa .
Završni koraci
< p >mješavina 50 mikrolitre i 100 mikrolitara svake reakcije trebaju biti stavljene izvan ” na LB + AMP + X – gal i ploča se inkubira bez tresenja preko noći na 37 ° C ” Slijedećeg dana su tri bijele kolonije iz svake reakcije treba izvadi i stavi u 4 ml LB + AMP i ostavi da se inkubira tijekom noći na temperaturi od 37 stupnjeva Celzijusa , dok se trese na 200 okretaja u minuti . Završni korak jemini – priprema plazmida i čekaju da vide hoće lipostupak bio uspješan .